PCR dalam diagnosa penyakit udang

Metode molekuler merupakan metode diagnosis yang cukup penting dalam diagnosa penyakit udang. Diagnosa penyakit udang yang paling banyak digunakan dalam waktu cepat dengan akurasi tinggi adalah menggunakan PCR. Probe gene pertama  dikembangkan untuk mendiagnosa penyakit udang IHHNV. Metode ini mengamplifikasi bagian unik dari genom patogen yang terdeteksi dengan sepasang primer spesifik.

Metode PCR menargetkan sebagian kecil dari asam nukleat patogen (RNA maupun DNA) yang diamplifikasi dengan bantuan deoxynucleotida dan DNA polymerase. PCR dapat mendeteksi patogen yang berjumlah banyak (dalam stadium infeksi berat) maupun patogen dalam jumlah sedikit (stadium awal atau tanpa gejala) dengan nested PCR. PCR sangat membantu dalam deteksi dini penyakit udang sehingga penyakit dikontrol lebih awal. PCR juga dapat mendeteksi karier, air, sedimen, untuk melihat adanya kontaminasi di lingkungan budidaya.

Deteksi patogen yang memiliki DNA lebih mudah dibandingkan patogen yang memiliki RNA. Hal ini dikarenakan DNA lebih stabil dan tidak mudah mengalami degradasi dibandingkan RNA. Metode PCR dibutuhkan untuk menganalisis DNA, kuantifikasi dan sekuensing. PCR dapatdigunakan sebagai alat uji konfirmasi yang dapat mendeteksi satu atau beberapa patogen sekaligus (multipathogen). Keakuratan diagnosa menggunakan PCR membutuhkan kualitas DNA yang baik, standar pengujian, dan validasi pengujian.

Sensitifitas dan spesifitas PCR

Sensitifitas dan spesifitas uji PCR sangat tinggi dibandingkan pengujian konvensional lainnya. Sensitifitas pada PCR bermakna seberapa efektif PCR dapat mendeteksi keberadaan DNA atau RNA target dalam sampel. Hal ini mengindikasikan kemampuan uji dalam mengidentifikasi penyakit. Sensitifitas pada PCR mengacu pada limit deteksi. Penting pada deteksi penyakit udang dengan PCR adalah mengetahui limit deteksi dari pengujian. Limit deteksi inilah yang akan menentukan apakah pengujian PCR tersebut dapat digunakan sebagai alat deteksi ini (screening) atau untuk pengujian. Kesensitifan PCR bergantung pada organ target yang digunakan, metode sampling single/pooling, dan tehnik pengawetan. Sedangkan spesifitas dapat diartikan sebagai kekhususan bahwa patogen tersebut dapat terdeteksi pada alat uji.

Pengambilan sampel PCR untuk deteksi penyakit udang

Sampling pada PCR dapat dilakukan secara lethal dan non lethal. Sampling non lethal biasanya menggunakan bagian pleopod dan tanpa mematikan udang. Kebanyakan sampel uji untuk PCR merupakan sampel yang dikumpulkan dalam satu wadah atau disebut dengan pooling. Namun sayangnya, tehnik pooling ini tidaklah akurat pada patogen dengan prevalensi rendah. Oleh karenanya untuk meminimalisir sampel yang tidak terdeteksi, sebisa mungkin pooling menggunakan organ target dari patogen agar deteksi lebih spesifik lagi.  Sampel untuk PCR dapat dalam bentuk segar, beku, atau diawetkan dalam etanol 70%.        

Tabel. Organ target pada penyakit udang yang digunakan untuk pengujian PCR

DNA/RNA	patogen	Organ yang sampling
DNA	WSSV	Larva, hemolim, insang, organ lymphoid, pleopod, jaringan ekto/mesodermal
	IHHNV	Larva, hemolim, insang, organ lymphoid, pleopod, jaringan ekto/mesodermal
	MBV	Larva, hepatopankreas, lambung, feses
RNA	TSV	Larva, insang, LO, pelopod
	IMNV	Larva, telson, pleopod, insang, oto, LO

*cetak tebal adalah nama organ yang paling sesuai untuk pengujian pCR

Kelebihan PCR

• Tehnik sampling PCR termasuk mudah. Sampel untuk pengujian PCR harus terjaga sterilitasnya, oleh karenanya pengambilan sampel PCR biasanya dilakukan lebih awal daripada pengujian lainnya. Cara pengawetannya juga mudah, dapat menggunakan etanol 70%, dry ice, nitrogen cair, RNA latter. Sampling PCR juga dapat dilakukan secara non lethal, misalnya dengan mengambil insang, pleopod dll. PCR juga dapat menggunakan sampel air dan sedimen.
• PCR sangat disukai oleh pembudidaya untuk mendeteksi patogen udang. PCR mampu mendeteksi patogen dalam konsentrasi rendah dan patogen yang berada pada suatu individu namun belum menimbulkan gejala klinis. Oleh karenanya metode PCR ini sangat cocok untuk digunakan sebagai metode untuk monitoring rutin penyakit.
• Disamping cepat, sensitif dan spesifik, PCR juga dapat diaplikasikan untuk multipatogen.
• Metode PCR dapat dilanjutkan dengan sekuensing.

Kekurangan PCR

• Kontaminasi
• Untuk menjamin keakuratan PCR, kalibrasi dan validasi harus sering dilakukan.

Alat yang dibutuhkan untuk pengujian PCR
Berikut ini adalah beberapa jenis alat yang umum digunakan untuk pengujian PCR

- mesin PCR
- Alat elektroforesis
- mikropipet
- microcentrifuge
- UV transilluminator
- Laminar air flow
- vortex
- spinner 

Jenis dan varian tehnik PCR

1. Nested PCR
   Adalah metode modifikasi PCR yang bertujuan untuk meminimalkan ikatan non spesifik akibat amplifikasi pada lokasi ikatan primer yang tidak diharapkan. Tehnik ini menggunakan dua set primer pada target yang sama dan dua reaksi PCR. Tehnik ini dapat membantu mendeteksi patogen dalam jumlah kecil atau DNA yang kualitasnya kurang baik.
2. Reverse-trasnkription PCR
   Tehnik ini adalah tehnik mengombinasikan reverse transkripsi RNA menjadi DNA (cDNA), digunakan untuk menghitung jumlah RNA spesifik dalam sampel.
3. Real time pCR
   Digunakan untuk mendeteksi dan mengkuantifikasi molekul DNA
4. Mulitplex PCR
   PCR ini menggunakan beberapa set primer dalam satu tabung reaksi. Pada prosedur ini, terdapat lebih dari satu target sekuensing yang diamplifikasi dalam satu reaksi. Dengan metode ini, deteksi akan lebih ekonomis dan dapat menggunakan sampel dalam jumlah sedikit. Kunci dari metode ini adalah desain beberapa primer dengan suhu annealing yang berdekatan dan amplifikasi perlu ditandai pada beberapa ukuran yang berbeda sehingga mudah terdiferensiasi pada proses elektroforesis.

Tahapan dalam pengujian PCR

1. Pengambilan sampel
2. Ekstrasi asam nukleat
3. Preparasi cDNA untuk pathogen dengan RNA
4. PCR mastermix yang terdiri dari RNAse/DNAse free water, buffer yang dikonsentrasikan dengan magnesium klorida, sepasang primer (forward dan reverse), dNTPs, DNA polymerasi, template (DNA atau cDNA)
5. Amplifikasi program PCR dalam thermocycler dengan beberapa siklus (denaturasi, annealing, extension)
6. Pemisahan produk PCR dalam gel agarose
7. Pembacaan/dokumetasi

Referensi untuk dibaca

IISAP UQ Training 2023

Lightner, D.V. Advances in Diagnosis and Management of Shrimp Virus Diseases in the Americas. Disease Control in Fish and Shrimp Aquaculture

Otta, S.K., S.V. Alavandi, K.K. Vijayan. 2017. Field Guide for Diagnosis, Prevention, and Control of Disease of Shrimp and Finfish in Brackish water Aquaculture. Central Institute of Brackishwater Aquaculture, 38pp

CIBA. 2016. Molecular Diagnosis of Shrimp Diseases - A Training Manual. CIBA-TM Series 2016 No. 4