Formulasi Terbaik Fiksasi Histologi pada Ikan

Fiksasi jaringan untuk histologi memegang peranan penting dalam pemeriksaan penyakit ikan. Fiksasi yang baik akan menentukan hasil pengamatan yang akurat dan tepat. Fiksasi bertujuan untuk mengetahui kondisi sel dan jaringan dari specimen sedekat mungkin dengan kondisi aslinya ketika masih hidup. Hal ini sekaligus mencegah terjadinya autolysis dan pembusukan. 

Fiksasi dilakukan pada suhu ruang selama 6-48 jam. Fiksasi yang baik harus disimpan dalam etanol 70% atay dalam neutral buffer formalin 10%. Penyimpanan dalam etanol akan mengembalikan warna yang hilang akibat fiksasi dengan formali serta tidak mempengaruhi hasil pewarnaan. Penyimpanan dalam buffer formalon menyebabkan hilangnya material basofilik pewarnaan.

Penyimpanan yang kurang baik akan menyebabkan kerusakan karena aldehida (akibat disimpan dalam formalin) menghambat aktifitas enzim dan mengoksidasi yang akan mempengaruhi pewarnaan. Meskipun penyimpanan dalam etanol masih yang terbaik, namun beberapa laboratorium tetap menggunakan formalin karena alasan ekonomis. Thompson (1966) merekomendasikan untuk jaringan yang difiksasi dalam buffer formalin tetap disimpan dalam buffer formalin.

Kimia Fiksasi
Fiksatif dapat bekerja sebagai koagulan atau non koagulan protein sel dan jaringan.  Pada pH yang isoelektrik, protein bersifat netral. Fiksatif menyebabkan kelarutan dan viskositas yang minimal, tekanan osmotic terendah, dan pembengkakan minimal. Pada jaringan hidup, protein alami merupakan larutan atau gel koloid. Fiksasi mengubah sebagian besar protein jaringan yang tidak larut yang kondisinya seperti jeli menjadi massa spongy.

Fiksatif pengkoagulasi seperti asam pikrat, merkuri klorida dan etanol memprepisipitasi protein membentuk clot sobekan untaian yang akan menstabilkan protein, membiarkan terjadinya penetrasi bahan pendehidrasi, clearing, dan embedding. Saat masuk ke jaringan, fiksatif ini akan memperkuat ikatan protein, memasukkan artefak ke dalam jaringan seperti perubahan membrane sitoplasma dan nucleus, dsb

Larutan fiksatif non koagulatif seperti formaldehyde dan osmium tetroxide tidak mengubah protoplasma dengan cara tersebut, menghasilkan perubahan sel dan jaringan yang minimal, mengurangi artefak. Fiksatif ini biasanya dikombinasikan untuk menyeimbangkan kondisi yang kurang menguntungkan dengan bahan lain

Bahan untuk fiksasi pada ikan

a. Formaldehyde
Formaldehyde merupakan salah satu larutan fiksatif yang umum digunakan untuk pemeriksaan histologi pada ikan. Formaldehyde mampu mengawetkan jaringan lebih baik daripada larutan fiksatif lainnya kecuali osmium tetraoksida. Konsentrasi maksimal formaldehyde adalah 40%. Namun demikian dalam penggunaannya tidak dalam bentuk terkonsentrasi namun harus dikombinasikan dengan bahan-bahan tertentu. Meskipun cukup baik namun formaldehyde tidak cukup nyaman digunakan sebab baunya yang dapat mengiritasi saluran pernafasan dan mata. Bahkan pada kulit sensitive dapat menyebabkan dermatitis.

Formaldehyde memiliki berat molekul yang rendah sehingga mampu mempenetrasi lebih cepat. Formalin merupakan larutan fiksatif yang baik untuk lemak dan jaringan keras namun tidak untuk karbohidrat terlaruy. Formalin tidaklah mahal serta mampu menjaga morfologi sel, antigenesitas dan marerial genetic sel.

b. Asam Asetat
Bahan ini merupakan salah satu bahan yang digunakan untuk fiksasi. Namun demikian bahan ini jarang digunakan sendiri sebab menyebabkan sel mengembang. Bahan ini tidak memfiksasi lemak dan karbohidrat. Asam asetat akan membuat jaringan lebih lunak daripada fiksatif lainnya.

Beberapa larutan fiksatif histologi ikan

a. Phosphate Buffer Formalin/ Neutral Buffer Formalin (NBF) 10%
Bahan:
100mL  Formaldehyde  (37-40%)
900mL  Aquades
4 gr       sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4H2O)/ sodium phosphate monobasic
6-6,5 gr disodium hydrogen phosphate (Na2HPO4)/ sodium phosphate dibasic (anhydrous)

NBF paling umum digunakan untuk histologi ikan. Larutan ini tidak banyak membuat perubahan jaringan, memfiksasi jaringan lebih detil, waktu fiksasi 8-24 jam saja.

b. Larutan bouin’s
Digunakan untuk organ keras seperti insang, mata, tulang. Tidak cocok untuk kulit sebab membuat lebih sulit 

Bahan:
750 mL   Picric acid
250mL  Formaldehyde 37-40%
50mL   Asam asetat glasial

Larutan ini juga banyak digunakan dalam histologi ikan. Larutan ini mempenetrasi dengan cepat dan tanpa pengerutan. Jaringan otot dan jaringan ikat akan terfiksasi dengan baik. Namun larutan ini tidak boleh digunakan jika jaringan akan diwarnai dengan Feulgen sebab menyebabkan hidrolisis berlebih pada asam nukleat. Formalin akan memfiksasi sitoplasma dan nukleoplasma. Asam pikrat mengkoagulasi sitoplasma.  Asam asetat menyebabkan jaringan membengkak dan memecah ikatan garam antar rantai  protein. Kandungan asam asetatnya menyebabkan tidak dapat digunakan apabila ingin memfiksasi jaringan dengan inklusi sitoplasma. Karena mengandung asam pikrat, larutan ini akan membentuk protein pikrat yang larut air sehingga harus dipindahkan ke dalam alcohol 50-79% untuk menghilangkan asam pikrat yang berlebihan. Disamping alcohol, dapat juga ditambahkan ammonium hidroksida hingga warna kuningnya keluar. Potongan kecil jaringan dengan ketebalan 2-3mm difiksasi selama 2-3 jam. Jaringan yang lebih besar difiksasi selama 24 jam. Fiksasi lebih dari 24 jam atau hingga berbulan-bulan menyebabkan nucleus sulit terwarnai.

c. Larutan Lillie’s
Larutan ini mirip dengan larutan Bouin’s. Perbedaannya adalah larutan asam asetat diganti dengan asam formiat. Kemampuan larutan Lillie’s serupa dengan Bouin’s. . Karena mengandung asam pikrat, larutan ini akan membentuk protein pikrat yang larut air sehingga harus dipindahkan ke dalam alcohol 50-79% untuk menghilangkan asam pikrat yang berlebihan. Keunggulan larutan ini dibandingkan Bouin’s adalah adanya asam formiat menjadikan kemampuan dekalsifikasinya lebih kuat dibandingkan asam asetat.

Bahan
850ml   Picric acid, 1-2% aqueous (1-2 g/100 ml water)
100mL  Formaldehyde (37-40%)
50ml  Formic acid, 90-95% aqueous
Fiksasi dilakukan selama 1-2 hari. Warna kuning dapat dihilangkan dengan merendam dalam alcohol 70-80% selama 2-3 hari.

d. Heidenhain’s ‘Susa’Bahan:
45gr  Mercuric chloride
5gr Sodium chloride
20gr Trichloracetic acid
40mL Acetic acid
200ml Formalin
800ml Distilled water

Larutan ini tidak lebih baik dibandingkan NBF namun cocok digunakan untuk fiksasi cepat pada jaringan berukuran kecil. Besar jaringan yang difiksasi tidak boleh lebih dari 5mm3 sebab kemampuan penetrasinya akan menurun setelah 2-3 menit dan jaringan tidak terfiksasi seluruhnya.
Jaringan dengan keteballan 2-3mm3 hanya boleh difiksasi selama 3-5 jam saja.  Lebih dari waktu ini harus dipindahkan ke larutan alcohol 95%.

e. Larutan Carnoy’s

bahan
60ml  Absolute alcohol
30ml  Chloroform
10ml  Acetic acid
250gr  EDTA
1750ml  Distilled water

Larutan ini jarang digunakan pada histologi ikan. Larutan ini memfiksasi secara cepat. Larutan ini dapat menyebabkan pengerutan dan banyak elemen sitoplasma yang hancur. Pengerutan dapat diturunkan dengan melakukan fiksasi pada suhu 0oC. Fiksasi jaringan dengan ketebalan 5mm dapat sempurna dalam 1-2 jam. Biopsi specimen kecil dapat terfiksasi dalam 15 menit.

f. Larutan Dietrich’s Larutan ini mirip dengan larutan Davidson’s. LArutan ini dapat memfiksasi sel dengan sedikit pengerutan. Spesimen dapat disimpan selama 2-3 bulan bila perlu tanpa membuat jaringan mengeras. Kandungan asam asetat glasial nya membuat larutan ini dapat digunakan sebagai dekalsifikasi. Jaringan yang disimpan dalam larutan Dietrich’s untuk waktu lama harus dibilas dengan air mengalir selama 24 jam untuk mencegah pembentukan presipitat hitam formalin. Larutan ini cocok untuk fiksasi ikan utuh dan jaringan ikan.
750ml   Distilled water
375mL  Ethanol (95%)
125ml  Formaldehyde (37-40%)
25ml  Glacial acetic acid

g. Larutan Davidson’sLarutan ini mirip dengan larutan Dietrich’s. Larutan ini cocok untuk fiksasi molusca Bivalvia apabila distilled water diganti dengan air laut. Larutan ini juga sering digunakan untuk ikan laut seperti salmon terutama untuk organ hati. Disamping itu Davidson’s juga baik untuk fiksasi gonad ikan.
200ml  Formaldehyde (37-40%)
100ml  Glycerol
100ml  Glacial acetic acid
300ml  Absolute alcohol
300ml  Distilled water

g. Larutan fiksatif lainnyaZenker’s
Helly’s
Formol saline

Referensi

Forunie,  J.W., Krol, R.M., Hawkins, W.E. 2000. Fixation of Fish Tissues dalam Ostrander, G (Ed). 2000. The Laboratory Fish. Academy Press

Reantaso M G., B.,  Mcgladdery S E, Subangsinghe. 2001. Asian Diagnostic Guide to Aquatic Animal Diseases. FAO Fisheries Technical Paper, No. 402, supplement 2. Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO), Rome, Italy, 240 pp.

Roberts, H.E. 2010. Fundamentals of ornamental fi sh health. Blackwell Publishing

Tusihadi, T., Kurniastuty, Dewi, J. 2007. Preparasi dan Pengelolaan Sampel dalam Pemeriksaan Penyakit dalam Balai Besar Pengembangan Budidaya Laut Lampung. 2007. Petunjuk Teknis Pengambilan Sampel. Seri Budidaya Laut no 15

Wildgoose, W.H (Ed). 2001. BSAVA Manual of Ornamental Fish. British Small Animal Veterinary Association