Hepatopankreatic microsporidiasis (HPM)

                     

Nama lain:  Enterocytozoon hepatopenaei (EHP)

Hospes : P. monodon, P. vannamei, P.stylirostris [1], P. japonicus,P. meruuiensis [11] . Spesies payau dan laut serta krustasea lainnya rentan terhadap parasit ini [1]. 

 

Etiologi/ penyebab: Enterocytozoon hepatopenaei, sporanya kecil ( panjang 1µm) [1]. Parasit ini merupakan parasite obligat intraseluler [2]. Karakteristik parasit dan pemberian nama parasit yang berasal dari udang windu dari Thailand ini pada tahun 2009 dilakukan oleh Tourtip [11]

Epizootiologi          

Pertama kali kasus microsporidia tak bernama ditemukan pada udang windu P. monodon yang mengalami perlambatan pertumbuhan. Kasus tersebut dilaporkan di Malaysia tahun 1989. Sedangkan di Australia kasus serupa terjadi pada P. japonicus pada tahun 2001. EHP bukanlah patogen eksotik namun lebih bersifat patogen endemik di Australasia [1]. Hasil PCR positif juga terdeteksi pada udang vaname yang dibudidayakan di Indonesia dan India [3]. Di Indonesia, EHP telah terdeteksi pada lokasi budidaya udang vaname seperti di Jawa Timur, Jawa Barat, Sumatera Utara, Lampung, dan sumatera bagian selatan, Bali, Lombok, dan Sulawesi [14]            

EHP dapat menyebar secara langsung melalui kanibalisme. Penyebaran secara kanibalisme tidak memicu adanya WFS (White faeces Syndrom) meskipun EHP dapat ditemukan pada udang terinfeksi WFS. Kemungkinannya adalah EHP sebagai faktor pemicu timbulnya WFD [1]. Hewan yang terinfeksi dapat melepaskan spora ke lingkungan melalui dekomposisi hewan yang mati, kanibalisme, dll. Sel hepatopankreas dan sel epitel yang terinfeksi secara umum mengalami peluruhan dan hancur dalam sistem pencernaan, mengakibatkan spora dilepaskan bersama feses yang kemudian berdiam selama beberapa saat tergantung kondisi lingkungan [11]. EHP juga dapat dijumpai pada udang yang terinfeksi WSSV [3].        

Penularan EHP terjadi secara horizontal [3]. Polychaeta dan moluska dapat terdeteksi positif parasite ini, namun tidak diketahui apakah keduanya dapat bertindak sebagai karier. Artemia yang dibekukan juga pernah terdeteksi positif parasite ini [1].  Kepiting dapat menjadi sumber penularan bagi udang [2]. Berbeda dengan microsporidia lain seperti Ameson (Nosema), Agmasoma (=Thelohania) Pleistophora (=Plistophora), penularan EHP tidak membutuhkan hospes intermedier [11].  Hal ini didukung dengan hasil dari studi Tang et al (2016) yang menyatakan bahwa penularan EHP dapat terjadi secara langsung baik melalui per os ataupun kohabitasi. 

      Penularan secara vertikal microsporidia pernah dilaporkan pada beberapa crustacea seperti Cragonyx sp (aphipoda air tanahh), melalui ingesti gonad. Oleh karena itu kemungkinan penularan secara vertikal EHP dapat menjadi sebuah kemungkinan [11].     Hingga saat ini belum diketahui prevalensi dari EHP. Studi dari Central Institute of Brackishwater Aquaculture (CIBA) mengindikasikan kejadian EHP sekitar 15,6% dari 100 pembudidaya. Sekitar 16% nya terdeteksi mengalami perlambatan pertumbuhan dan sebesar 50% mengalami sindrom berak putih [11]. Mortalitas yang disebabkan oleh EHP cukup bervariasi, laporan dari pembudidaya menunjukkan sebanyak 1-2% mortalitas harian [15].

Faktor pendukung Stressor lingkungan dan atau patogen mungkin dapat mengubah homeostatic fisiologis ketahanan udang sehingga microsporidia dapat bereplikasi tanpa batasan [8]

Gejala Klinis Tidak ada gejala klinis menciri kecuali perlambatan pertumbuhan [1].  Infeksi parasite ini juga banyak dikaitkan dengan sindrom berak putih (WFD- white faeces disease) [7]. Pada sampel udang windu yang diamati oleh Anderson et al (1988), udang menghitam, berukuran kecil, letargi, tanpa ada lesi secara makroskopis.                    

Gb. Gejala Klinis EHP pada udang vaname. A. udang mengalami perlambatan pertumbuhan pada usia 90 hari B. Udang dengan EHP saluran pencernaan kosong (panah). C. Terddapat adanya berak putih (panah) (foto dari CIBA E publication, 2016)

Perubahan patologi            

Parasit ini hanya menginfeksi sel epitel tubulus hepatopankreas dari jaringan udang. Pada hepatopankreas secara histologi teramati serupa badan inklusi basofilik sitoplasmik yang berisi sekumpulan spora berbentuk elips hingga ovoid berukuran 1,1 ± 0,2 x 0,6-0,7 ±0,1µm. Terkadang spora tersebut dapat lepas dari sel yang lisis ke dalam lumen tubulus [3]. E. hepatopenaei menginfeksi semua tipe sel dari epitel hepatopankreas kecuali sel F [12] Pengamatan dari Santhoskumar et al (2016) menunjukkan adanya gambaran menciri EHP dimana  plasmodium parasit ini berkembang dalam vakuola HP. Mikrosporidia lain tidak masuk dalam vakuola dan hanya berkembang pada sitoplasma saja. Perkembangan microsporidia EHP pada vakuola terbagi menjadi dua stadium, stadium awal struktur plasmodium basofilik padat dan fase akhir ditandai dengan spora yang masak berukuran1-1,2 µm x 0,5-0,6µm [10]. Plasmodium berbentuk multinuclear sedangkan spora terdiri dari satu inti, 5-6 coil pada filament polar, vakuola posterior, anchoring disk yang melekat pada filament polar, serta dinding padat electron [15]

Spora ini berupa struktur asidofilik yang dibatasi vakuola dalam sitoplasma sel E, F, B, dan R. Tidak ada spora yang ditemukan di sel epitel midgut dan hindgut ataupun sel jaringan dan organ lain[13]. Namun demikian studi dari Tang et al (2016) menemukan hal yang tak biasa dimana inklusi dari EHP ditemukan di sel epitel midgut [14]. Spora yang masak juga dapat teramati dalam lumen HP. Tubulus HP yang terinfeksi EHP terkadang dikelilingi oleh agregat hemosit [13] Studi lebih lanjut mengenai stadium sporogoni dan perkembangan EHP pada sel hospes dijelaskan oleh Tourtip et al  (2009).          

         Pada udang windu, sejumlah tubulus pada bagian proksimal hepatopankreas berdilatasi dan dibatasi oleh sel epitel yang memipih. Lumen tubulus terisi oleh debris granuler pucat atau sel nekrosis dan bentukan serupa spora refraktil, oval, dan kecil. Lebih dari 40% sel hepatopankreas mengandung bentukan serupa spora intrasitoplasmik. Spora ini berdifusi pada sitoplasma dan tidak terdapat dalam vakuola. Beberapa tubulus yang memiliki bentukan serupa spora dalam lumen mengalami nekrosis dengan enkapsulasi hemositik melanisasi multiple. Edema dan peningkatan sejumlah hemosit pada jaringan interstitial merupakan perubahan umum dari hepatopankreas yang terinfeksi [8]. Hepatopankreas yang terinfeksi berat mengalami nekrosis disertai sloughing sel epitel tubulus, degenerasi, dan akumulasi spora di lumen [6].  Pemeriksaan secara biokimiawi untuk EHP dengan hemolim menunjukkan adanya peningkatan ezim AST (Aspartat Transaminase), ALT (Alanin Transferase), dan ALP (Alkalin Phosphatase). Ketiganya merupakan parameter umum untuk menunjukkan kerusakan pada hati. Pada EHP meningkatnya ketiga enzim tersebut dapat disebabkan oleh kerusakan dan kematian sel hepatopankreas [10]

Gb. Gambaran hepatopankreas yang mengalami sloughing bersama dengan plasmodium awal (ePM dan akhir (IPm). Plasmodium dewasa (s) berada di dalam plasmodium akhir pada lumen HP (Santhosh Kumar et al., 2016)

.

Gb. Epitel tubulus HP terlepas dari membrana basalis. Di ruang antar tubulus terdapat gambaran serupa spora ( picture credit to Rajendran et al, 2015)                      

 

Patogenesis
Parasit ini menginfeksi hepatopankreas (kelenjar pencernaan) kemudian membatasi jumlah nutrisi yang mampu diserap oleh hepatopankreas. Akibatnya, udang menjadi kelaparan sehingga timbul perlambatan pertumbuhan [9]

Metode Diagnosa
 Nested PCR, In Situ Hibridisasi, LAMP, real time PCR dapat digunakan untuk deteksi EHP. Pengujian dapat menggunakan feses, indukan, PL, dan udang. Pengecekan juga dapat menggunakan smear hepatopankreas yang dilihat dengan mikroskop cahaya perbesaran 1000x [1].  Pemeriksaan histopatologi dapat dilakukan untuk mendeteksi penyebaran EHP baik secara percobaan  maupun infeksi alami. Pada pemeriksaan histopatologi EHP sebagian besar ditemukan di hati dan sedikit di lambung, tidak pada organ yang lain. Namun demikian pada pemeriksaan PCR, EHP dapat terdeteksi pada semua organ termasuk jantung [10]. Penggunaan mikroskop untuk deteksi cepat EHP hanya dapat dilakukan apabila hewan menunjukkan infeksi berat pada HP [6]. Diakui bahwa deteksi EHP secara parasitologi konvensional sangatlah sulit, terlebih dengan ukuran spora yang sangat kecil. Jithendran et al (2015) mengembangkan metode parasitologi menggunakan sampel lapangan. Metode meliputi pengapungan (floatation) menggunakan larutan Sheather’s sugar atau sedimentasi menggunakan dietil eter/ formalin. Selanjutnya dilakukan pewarnaan trichrome, khusus untuk microsporidia.  Metode Ryan-blue juga dapat digunakan untuk menghasilkan warna pink pada spora dan kebiruan untuk latar (debris). Metode yang terakhir dapat mendeteksi spora baik dengan infeksi secara ringan ataupun berat [7]

Diagnosa diferensial Kasus pada udang yang disebabkan oleh microsporidia hanyalah Agmasoma penaei yang ditemukan di udang P. monodon, P. merquensis, P. vannamei. A. penaei ini ditemukan di otot dan jaringan ikat (termasuk jaringan ikat hepatopankreas namun tidak pernah menginfeksi tubulus HP). Gambaran makroskopis yang terlihat adalah perubahan warna serupa susu (milky) pada otot akibat kumpulan spora microsporidia. Oleh karena itu penyakitnya sering disebut dengan “cotton shrimp disease” atau “penyakit udang susu” di Amerika dan “white back disease” di Thailand [1]. Perbedaan lainnya adalah A. penaei disebarkan secara tidak langsung melalui hospes perantara [4].

Pencegahan dan Pengendalian      
 Pencegahan EHP pada tahap pembenihan dan pembesaran
adalah tidak pernah menggunakan hewan tangkapan atau hewan hidup (Polychaeta, kerang,dll)  sebagai pakan untuk indukan. Apabila tetap menggunakan, pakan harus dibekukan atau dipasteurisasi (pemanasan suhu 70^oC selama 10 menit). Radiasi gamma  juga dapat digunakan dengan pakan beku [1, 5].   Pada hatcheri, EHP dapat diduga dari post larva yang mengalami perlambatan pertumbuhan.Fasilitas baik pembenihan maupun pembesaran harus bersih. Hal itu dapat dilakukan dengan memindahkan udang dari hatcheri kemudian dengan 2,5% larutan sodium hidroksida  (25gms NaOH/L air) dibersihkan dan dibilas setelah 3 jam. Perlakuan ini juga dilakukan untuk peralatan, filter, tandon, dan pipa.  Setelah perlakuan dengan NaOH hatcheri didiamkan selama 7 hari dan dibilas dengan acidified chlorine (200ppm larutan klorin pH <4,5). Indukan ada baiknya untuk dicek untuk EHP [5].      

Di tambak, terdapat dua hal yang harus diperhatikan untuk mengontrol EHP. Pertama adalah menggunakan benih bebas EHP. Dan yang kedua adalah persiapan tambak dengan baik, terutama pada tambak yang pernah mengalami kasus EHP. Spora EHP memiliki dinding yang tebal dan tidak mudah diinaktivasi. Bahkan klorin dosis tinggi juga tidak efektif. Pada tambak dengan dasar tanah dapat menggunakan CaO 6 ton/ha di sedimen yang telah kering (10-12cm) kemudian dibasahi untuk mengaktifkan kapur. Kondisi tersebut didiamkan selama 1 minggu sebelum dikeringkan atau dilakukan pengisian. Pasca pengapuran, pH akan naik menjadi 12 atau lebih selama beberapa hari dan kembali ke normal [5]. Karena EHP merupakan parasit yang membentuk spora, disinfeksi air dan identifikasi karier potensial dapat menjadi pertimbangan penting [13]

Referensi

1. Thitamadee, S., Anuphap Prachumwat, Jiraporn Srisala, Pattana Jaroenlak, Paul Vinu Salachan, Kallaya Sritunyalucksana, Timothy W. Flegel, Ornchuma Itsathitphaisarn. 2015. Review of Current Disease Threats for Cultivated Penaeid Shrimp in Asia. doi: 10.1016/j.aquaculture.2015.10.028                      

2. Chiyansuvata, P., Chatangsi, C., M Chutmongkonkul, J Tangtrongpiros, N Chansue. 2015. Molucular Biological screening of Enterocytozoon hepatopenaei in Aquatic Macro Fauna in Pacific White Shrimp(l. vannamei) Pond. [Proceedings] 14^th Chulalongkorn University Veterinary Science                      

3. Anonim. Disease of Crustaceans – Hepatopancreaic Microsporidiasis caused by Enterocytozoon hepatopenaei (EHP). NACA                      

4.Tangprasittipap, A., Jirapom Srisala, Saisunee Chouwdee, Montagan Somboob, Niti Chuchird, Chalor Limsuwan, Thinnarat Srisuvan, Timothy W Flegel, Kallaya Sritunyalucksana. 2013. The Microsporidian Enterocytozoon hepatopenaei is Not The Cause of White Faeces Syndrom in White Leg Shrimp Penaeus (Litopenaeus) vannamei. BMC Veterinary research 2013 9:139

5. Sritunyalacsana, K., Piyachat Sanguanrut, Paul Vinu Salachan, Siripong Thitamadee, Timothy W Flegel. Urgent Appeal to Control Spread of The Shrimp Microsporidian Parasite Enterocytozoon hepatopenaei (EHP).

6. Rajendran, K.V., Saloni Shivam, P.Ezhil Praveena, J. Joseph Sahaya Rajan, T. Sathish Kumar, Satheesha Avunje, V. Jagadeesan, S.V.A.N.V. Prasad Babu, Ashish Pande, A. Navaneeth Krishnan, S.V. Alavandi, K.K.Vijayan.2016. Emergence of Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) in farmed Penaeus (Litopenaeus) vannamei in India. Aquaculture (2016), doi: 10.1016/j.aquaculture.2015.12.034

7. Jit Hendran, K.P., P Ezhil Praveena,  T Bhuvanesvar, J Joseph Sahaya Rajan, V Jagadeesan, A Navaneeth Krishnan. 2015. An improved microscopic method for the diagnosis of Enterocytozoon hepatopenaei in shrimp farms. CIBA

8. Anderson, I.G., M. Shariff, G. Nash. 1989. A Hepatopancreatic Microsporidian in Pond-Reared Tiger Shrimp, Penaeus monodon, from Malaysi. Journal of Invertebrate Pathology 53, (278-280)

9. Anonim. EHP Parasite  Threatens Shrimp Farm. Fis.com

10. Santhoshkumar, S.,  S Sivakumar, S Vimal, S Abdul Majeed, G Taju, P Haribabu, A Uma, A S Sahul Hameed. 2016. Biochemical changes and tissue distribution of Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) in naturally and experimentally EHP-infected whiteleg shrimp, Litopenaeu vannamei (Boone, 1931), in India. Journal of Fish Disease 2016 doi:10.1111/jfd.12530

11.Otta, S.K.  P.K. Patil, K.P. Jithendran, K.V. Rajendran, S.V. Alavandi, K.K. Vijayan. 2016. Managing Enterocytozoon hepatopenaei (EHP), microsporidial infections in vannamei shrimp farming: An Advisory. CIBA e-publication No.29; January 2016

12.Tourtip, S., Somjai Wongtripop, Grant D. Stentiford, Kelly S. Bateman, Siriporn Sriurairatana, Jittipan Chavadej, Kallaya Sritunyalucksana, Boonsirm Withyachumnarnkul.  2009. Enterocytozoon hepatopenaei sp. nov. (Microsporida: Enterocytozoonidae), a parasite of the black tiger shrimp Penaeus monodon (Decapoda: Penaeidae) Fine structure and phylogenetic relationships. Journal of Invertebrate Pathology 102 (2009) 21–29, doi:10.1016/j.jip.2009.06.004

13. Biju, N., Sathiyaraj, G., Raj, M., Venu Shanmugam, Babu Baskaran, Umamaheswari Govindan, Gayathri Kumaresan, Karthrick Kannan Kasthuriraju, Thampi Sam Raj Yohannan Chellamma. 2016. High Prevalence Of Enterocytozoon hepatopenaei in Shrimp Penaeus monodon and Littopenaeus vannamei Sampled From Slow Growth Ponds in India. Disease of Aquatic Organisms Vol 120: 225-230 doi:10.3354/dao03036

14 Tang, KFJ., Han, J E., Aranguren, L.F., Brenda White-Noble, Margeaux M Schmidt, Pathrapol Piamsomboon,  Eris Risdiana, Bambang Hanggono. 2016. Densa Populations of The Microsporidian Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) in Feces of Penaeus vannamei Exhibiting White Faeces Syndrome and  Pathways of Their Transmission to Healthy Shrimp. journal of Invertebrate pathology 140(2016) 1-7

15 Tang, KFJ., Pantoja, CR., Rita M Redman., Jee Eun Han, Loc H Tran., Donald V Lightner. 2015. Development of in Situ Hybridization and PCR Assay for The Detection of Enterocytozoon hepatopenaei (EHP), a Microsporidian Parasite Infecting Penaeid Shrimp.  Journal of Invertebrate Pathology 130 (2015) 37-41